Рис. 1. Сравнение последовательности аминокислот в человечьей и туберкулезной ЛРСазе. Красной рамкой обведены аминокислоты деятельного центра. Синее заполнение указывает на полное совпадение, лазурное — частичное совпадение (близкие по структуре аминокислоты), красное — несовпадение. Рисунок из обсуждаемой статьи в Bioorganic & Medicinal Chemistry
Коллаборация украинских и канадских химиков опубликовала две труды, в которых предлагаются принципиально новые потенциальные лекарства от туберкулеза, устремлённые на селективную деактивацию фермента лейцил-тРНК-синтетазы (ЛРСазы) туберкулезной палочки Mycobacterium tuberculosis.
Несмотря на успехи нынешней медицины, туберкулез остается одним из смертоносных заболеваний. Так, только в 2014 году в мире от туберкулеза умерли полтора миллиона человек, основным образом в развивающихся странах. Но и в развитых странах проблему еще спозаранку считать решенной, особенно в связи с появлением бактерий, устойчивых к популярным антибиотикам. И это значит, что гонку вооружений с микробами останавливать невозможно ни в коем случае.
Чтобы находить новые лекарства от бактериальных заболеваний, вытекает сначала найти подходящую мишень — например, какой-либо необходимый для существования белок-фермент, который будет сильно различаться в патогенных бактериях и в человеке и какой можно химически заблокировать, не дать выполнять биохимическую функцию. Тогда можно надеяться, что с большенный вероятностью молекула, блокирующая бактериальный белок, не будет блокировать человечий аналог.
В середине 2000-х годов был предложен новый класс мишеней для блокировки — аминоацил-тРНК-синтетазы (АРСазы). По-иному говоря, было обнаружено, что некоторые бактериальные (прокариотные) АРСазы зачастую будет сильно отличаются от эукариотных, и, в частности, человеческих, аналогов.
АРСаза — фермент-синтетаза, катализирующий образование вязки аминокислоты с тРНК перед встраиванием последней в синтезируемый белок. АРСазы обеспечивают правильность выходящего в дальнейшем считывания генетической информации с мРНК при синтезе белков на рибосомах. Для любой аминокислоты существует своя аминоацил-тРНК-синтетаза.
К туберкулезу искатели антибиотиков-ингибиторов АРСазы до сих пор не подобрались во многом потому, что не бывальщины получены кристаллические трехмерные структуры этих ферментов, то кушать было не совсем понятно, по каким признакам определять потенциальные снадобья. Однако первичная структура (последовательность аминокислот в белке) у кое-каких туберкулезных АРСаз, в частности у лейцил-тРНК-синтетазы (ЛРСаза) была популярна, также было известно, какие именно аминокислоты есть в активном центре. Ученые из Института молекулярной биологии и генетики УАН (Киев, Украина) и Otava Ltd. (Вон, Онтарио, Канада) разрешили использовать имеющуюся информацию довольно оригинальным образом.
Трехмерная структура и буквальное строение активного центра были известны у другой бактериальной ЛРСазы, относящейся грамотрицательной бактерии Thermus thermophilus. Аминокислотные последовательности ЛРСаз Mycobacterium tuberculosis и T. thermophilus имеют итого лишь 37-процентное сходство, однако непосредственно в активном середине их сходство — 95%, в то время как с аминокислотными последовательностями активного середины человеческой ЛРСазы сходство минимально (рис. 1).
Таким образом, используя структуру ЛРСазы T. thermophilus как штамп, исследователи построили модель ЛРСазы M. tuberculosis. Теперь в бой вступила хемоинформатика. Ученые взяли базу из 100 000 многообразных маленьких молекул и протестировали их виртуально на предмет взаимодействия с деятельным центром модели несколькими алгоритмами, часть которых разработали они сами. Это дало возможность сжать список кандидатов в ингибиторы до 270. Эти 270 кандидатов бывальщины протестированы экспериментально на их способность блокировать ЛРСазу M. tuberculosis. Тесты заметили, что сильными ингибирующими свойствами (IC50 < 50 мкмоль) обладают 6 молекул, какие принадлежат к двум различным структурным классам (рис. 2).
Рис. 2. Представители двух замеченных классов молекул, ингибирующих ЛРСазу M. tuberculosis. Молекула 1: {[4-(4-Bromo-phenyl)-thiazol-2-yl]hydrazonomethyl}-2-methoxy-6-nitro-phenol. Молекула 2: 5-(2-Hydroxy-5-methylphenylamino)-6-methyl-2H-[1,2,4]triazin-3-one. Рисунок из обсуждаемой статьи в Bioorganic & Medicinal Chemistry
IC50 (концентрация полумаксимального ингибирования) — показатель эффективности ингибитора, количественный индикатор, какой показывает, какова должна быть концентрация ингибитора, чтобы замедлить биологический процесс в условиях максимальной скорости на 50%.
Рис. 3. Компьютерная модель деятельного центра ЛРСазы M. tuberculosis, связанного с молекулой 1. Водородные связи показаны травяным точечным пунктиром. Также молекулы создают гидрофобные и иные взаимодействия (на рисунке не показаны). Рисунок из обсуждаемой статьи в Bioorganic & Medicinal Chemistry
Рис. 4. Компьютерная модель деятельного центра ЛРСазы M. tuberculosis, связанного с молекулой 2. Рисунок из обсуждаемой статьи в Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry
На рис. 3 и 4 показаны компьютерные модели молекул 1 и 2, встроенных в деятельный центр ЛРСазы M. tuberculosis. С помощью этих моделей можно изучить механизм ингибирования — постигнуть, как именно структурные детали молекул взаимодействуют с аминокислотами патогенного фермента. В число таких взаимодействий входят водородные связи, гидрофобные и иные слабые (но в совокупности достаточно сильные) взаимодействия.
На основе полученных знаний о структуре молекул можно эту структуру оптимизировать так, чтобы молекулы еще концентрированнее связывались с активным центром туберкулезной ЛРСазы. Используя эти эти, были синтезированы 26 аналогов молекулы 1 и 62 аналога молекулы 2. Среди аналогов молекулы 1 бывальщины найдены 6 высокоактивных молекул с IC50 < 20 мкмоль, из них самый низенький IC50 (6 мкмоль) — у самой молекулы 1. Среди аналогов молекулы 2 бывальщины найдены две высокоактивные молекулы (у обеих IC50 в районе 7,5 мкмоль).
Все деятельные молекулы были протестированы на предмет ингибирования человеческой ЛРСазы — и во всех случаях их активность к патогенному белку была как минимум в 10 раз рослее. В случае наиболее активной молекулы 1 было продемонстрированно, что она способна проходить через мембрану бактерий M. tuberculosis и предотвращать их рост при IC50 = 10,01 мкмоль и IC90 = 13,53 мкмоль.
Авторы пришагали к заключению, что найденные молекулы являются хорошими кандидатами на роль антитуберкулезных антибиотиков. Разумеется, отсюда до лекарств путь еще очень далек, как по времени так и по денежкам.
