Рис. 1. Три белка р53 (показаны травяным, голубым и розовым) рядом с молекулой ДНК (оранжевая). Рисунок с сайта bioquest.org
Понижение активности основного антионкогена клетки белка р53 может приводить к развитию злокачественных опухолей. Ученым удалось обрисовать новый механизм регуляции активности р53. В норме негативно заряженный домен белка SET связывается с положительно заряженным С-концевым доменом белка р53 и подавляет активность р53. В состоянии клеточного стресса лизиновые останки С-концевого домена ацетилируются и комплекс с SET не образуется, а р53 остается деятельным. Механизм регуляции посредством ацетилирования может быть присущ и ряду других белков.
Фактор транскрипции р53 — продукт гена ТР53, какой иногда называют главным антионкогеном клетки, — экспрессируется во всех клетках организма. Механизмы функционирования этого белка изучаются немало лет, но до сих пор есть много связанных с ним вопросов, на которые у ученых пока нет ответов. Популярно, что если с клеткой все в порядке, то белок р53 не активен. Но при некоторых внутренних (так, при повреждении ДНК) или внешних (например, при недостатке кислорода) условиях он активируется, приобретая способность связываться с определенным участком ДНК, и может запускать транскрипцию линии генов. В зависимости от ситуации это может приводить к замедлению процессов клеточного деления или даже к апоптозу. Детально о функциях этого белка мы рассказывали в новости На пути к детальному каталогу раковых генов, «Элементы», 06.04.2015.
От белка p53 в буквальном резоне зависит жизнь клетки, поэтому в нормальных условиях клетки должны содержать под строгим контролем его активность. А вот в условиях стрессов, которые могут повергнуть к злокачественному перерождению клетки, этот контроль должен быть экстренно обессилен. Ясно, что почти любое нарушение в системе контроля за активностью белка р53 может приводить к положительным последствиям, в том числе и развитию онкологических заболеваний (см.: Главный боец с опухолями ген ТР53 может превращаться в онкоген, «Элементы», 11.11.2015): в клетках раковых опухолей нередко встречаются мутации в гене ТР53.
Клетка может взаимодействовать с белками различными способами. В частности, уже синтезированные белки могут подвергаться так именуемым посттрасляционным модификациям, которые способны существенно влиять на свойства белков. Одинешенек из видов таких модификаций — ацетилирование, то есть присоединение остатка уксусной кислоты. Будет давно было показано, что ацетилирование лизинов в С-концевом домене (C-terminal domain, CTD) белка р53 приводит к тому, что у него является способность связываться с определенными участками ДНК (W. Gu, R. G. Roeder. 1997. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain). Делеции CTD у лабораторных мышей приводили к активации р53, что позволило предположить роль CTD как участка взаимодействия с негативными регуляторами функции р53. Но что это за регуляторы и какова роль ацетилирования CTD белка р53 во взаимодействии с регуляторами — оставалось незнакомым.
С целью получить ответы на эти вопросы группа ученых из научных учреждений США и Китая синтезировала неацетилированный (Ас−) и ацетилированный (Ас+) варианты пептида, воображающего собой CTD белка р53 (рис. 2). Эти пептиды соединили с нерастворимым носителем сквозь биотин, позволяющий прочно фиксировать их на носителе, и проанализировали клеточные белки, способные связываться с пептидами. С Ас+ пептидом не связывались утилитарны никакие белки, а в комплексе с CTD-Ас− обнаруживался белок молекулярного веса ~38 кДа. С поддержкой масс-спектрометрии пептидов, образующихся при расщеплении этого белка, он был идентифицирован как белок SET.
Рис. 2. Схема постройки белка р53 и связанного с биотином С-концевого домена (CTD), использованного в экспериментах. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature
О белке SET популярно довольно мало. Показано, что это онкопротеин, синтез которого активируется при заостренной миелоидной лейкемии (M. von Lindern et al. 1992. Can, a putative oncogene associated with myeloid leukemogenesis, may be activated by fusion of its 3′ half to different genes: characterization of the set gene). И желая уже было показано, что SET взаимодействует с белком р53 (J. Y. Kim et al. 2012. Inhibition of p53 acetylation by INHAT subunit SET/TAF-Iβ represses p53 activity), функциональные последствия этого взаимодействия и роль ацетилирования CTD белка р53 оставались незнакомыми.
В обсуждаемой работе было прямо показано, что взаимодействие очищенного от излишних молекул и структур клетки белка SET с CTD белка р53 при ацетилировании заключительного блокируется (рис. 3). Более того, экспрессия фермента СВР, ответственного за ацетилирование CTD белка р53, подавляла связывание SET с нормальным р53, но не с мутантным р53(в каком произошла замена лизина на аргинин), неспособным к ацетилированию. Альтернативные модификации CTD белка р53 (метилирование и ряд иных) на его взаимодействие с SET не влияли. Следовательно, именно ацетилирование играет ключевую роль при взаимодействии белков р53 и SET в клетке.
Рис. 3. Схема регуляции активности белка р53 сквозь ацетилирование С-концевого домена. а — в условиях стресса ацетильные группы (Ас) присоединяются к шести лизиновым аминокислотным остаткам С-концевого домена белка р53 (CTD). Этот белок может связываться со специфическим участком ДНК и взаимодействовать с одним из белков-коактиваторов транскрипции — СВР или р300, какие ацетилируют гистоны. Комплекс этих событий активирует транскрипцию с промоторов, контролируемых р53. b — в отсутствие стресса С-концевой домен белка р53 не ацетилируется, и негативно заряженный домен белка SET, обогащенный «кислыми» аминокислотными остатками, может связываться с ним. Несмотря на то, что комплекс р53+SET по-прежнему может связываться с ДНК, он не может взаимодействовать с р300 или СВР, и потому транскрипция подавляется. Рисунок из синопсиса к обсуждаемой статье в Nature
SET как таковой не способен связываться с ДНК. Но в присутсвии р53 наблюдалось образование комплекса SET/р53/ДНК. Для дефиниции влияния SET на функцию р53 как фактора активации транскрипции в клетке применили систему репортерного гена люциферазы (сделав так, что ген флюоресцирующего белка люциферазы, внедренный в клетку, очутился под контролем промотора, активируемого р53). Экспрессия люциферазы в клетке подавлялась в комбинации обыкновенных р53 и SET, но не подавлялсь в комбинациях с лишенным CTD белком р53 или с SET, лишенным кислотного домена. В всеобщем, полученные результаты однозначно свидетельствовали, что SET, образуя комплекс с р53, подавляет его активность, а ацетилирование CTD у р53 предотвращает образование такого комплекса, и активность р53 не подавляется.
На нескольких цивилизациях клеток было показано, что подавление экспрессии SET с помощью siРНК, подавляющих передачу мРНК гена SET в белок, существенно усиливает экспрессию линии генов, контролируемых р53. И, что соответствует функциям р53, рост клеток при этом подавлялся. В экспериментах на ксенографтных опухолях мышей (в этом случае опухолей, вызванных пересадкой мышам клеток НСТ116, полученных из колоректальной карциномы человека) при выключении SET остро подавлялся рост опухолей (рис. 4). Это подавление вызывало регрессию опухолей, в каких экспрессировался р53. У опухолей, в которых активный р53 отсутствовал, регрессии не случилось.
Рис. 4. Влияние экспрессии гена SET на рост опухолей с нормальным (слева) и задушенным (справа) геном TP53. В левый бок каждого животного бывальщины введены контрольные опухолевые клетки, в правый бок — опухолевые клетки, в каких экспрессия SET была подавлена с помощью siРНК. Внизу — вытянувшиеся опухоли. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature
В домене SET, взаимодействующем с р53, из 46 составляющих его аминокислот немало 76% являются «кислыми». В базе данных авторы отыщи еще 49 белков с подобными доменами, среди которых очутились белки, способные взаимодействовать с р53. Также как и SET, эти белки могут образовывать комплексы с неацетилированным CTD белка р53, а с ацетилированным — не могут. Авторы полагают, что регуляторная роль ацетилирования и взаимодействия белков с мощно кислыми доменами других белков не ограничивается только белком р53, а является довольно широко распространенным механизмом регуляции.
Физиологическое значение замеченного взаимодействия регуляторных белков с CTD белка р53 было изучено на лабораторных мышах, у каких был изменен этот домен. Авторы заменили шесть лизиновых остатков CTD белка р53 мышей на глутаминовые, сделав псевдоацетилирование лизинов, что отняло CTD способности взаимодействовать с SET. Мыши с такой мутацией погибали или внутриутробно, или сквозь день после рождения от неконтролируемой гибели клеток мозга. Если мышата все-таки рождались, то их мозг был существенно меньше, чем у контрольных. Следственно, в период эмбрионального развития необходим строгий контроль активности белка р53. Разрушение у мышей гена, кодирующего SET, приводило к похожим последствиям, что указывает на возможную связь наблюдавшихся эффектов собственно с активностью SET. Однако пока остается недоказанным участие или неучастие в летальности каких-то иных функций SET помимо взаимодействия с р53.
Высокий терапевтический противораковый потенциал ингибиторов SET авторы продемонстрировали также в экспериментах на мышах. Ранее было показано, что SET ингибирует фермент фосфатазы 2А, супрессора опухолей, подавляющего ряд сигнальных линий, которые избыточно активированны при многих раках. Следовательно, если рассмативать применение ингибиторов SET как противораковые оружия, то их воздействие может не ограничиваться активацией р53. Поэтому необходимо учитывать весь комплекс последствий нарушения функций SET. Кроме того, отдельный мутации р53 могут превращать этот антионкоген в онкоген (Основной борец с опухолями ген ТР53 может превращаться в онкоген, «Элементы», 11.11.2015). Разумеется, в таких случаях подавлять функцию SET невозможно. Но, в общем, применение ингибиторов SET в комбинации с активаторами ацетилирования представляется многообещающим подходом для лечения немало форм рака.
