Рис. 1. Многощетинковый трубчатый червь Hydroides elegans. А — колония взрослых индивидуумов; Б — свободноплавающая личинка. Фото с сайта scientificamerican.com
Развитие трубчатых многощетинковых червей проходит с метаморфозом, при каком свободноплавающая личинка превращается в сидячую взрослую особь. Непременным условием протекания метаморфоза у этих животных является контакт с бактериями Pseudoalteromonas luteoviolacea, какие образуют биопленки на поверхностях подводных объектов. Исследователи из Америки и Швейцарии изучили молекулярные механизмы, обеспечивающие специфическое взаимодействие между червем и бактериями и опосредованную этим взаимодействием регуляцию метаморфоза. Очутилось, что в передаче сигнала задействованы гены бактерий, полученные ими в прошедшем от бактериофагов. Контакт бактерий с личинкой червя запускает у нее сигнальные каскады MAPK, активирующие киназы p38 и Jnk, какие, в свою очередь, включают транскрипцию группы генов, участвующих в онтогенетических обращениях личиночных тканей и органов в процессе метаморфоза.
Гидроиды (Hydroides) — это одинешенек из родов трубчатых червей (семейство Серпулиды), класса многощетинковых червей. Их специфическая особенность — сидячий образ жизни и формирование известковых трубок, в каких они прячутся от хищников. На голове эти черви несут красивые венчики жаберных лопастей, какие служат им одновременно и органами дыхания, и приспособлениями для улавливания частичек еды. Один из их представителей — Hydroides elegans, широко распространенный вид в морях и океанах тропических и субтропических широт. Эти черви формируют массивные колонии на различных подводных объектах, в том числе на днищах морских кораблей, что представляет серьезную экономическую проблему. Вместе с тем они входят в число спокойных модельных организмов для биологических исследований.
В своем развитии гидроиды проходят сквозь стадию свободноплавающей личинки, которая должна найти подходящее пункт для прикрепления и дальнейшего превращения во взрослую сидячую особь. Выбор пункты важен, поскольку от него зависит, во-первых, обилие еды и, во-вторых, наличие поблизости потенциального полового партнера для созданья потомства. Оказалось, что метаморфоз личинок у H. elegans инициируется бактериями Pseudoalteromonas luteoviolacea, формирующими биопленки на поверхностях подводных камней (а также подводных долей морских судов). Этот факт был обнаружен еще в 1999 году (см. C. R. C. Unabia, M. G. Hadfield, 1999. Role of bacteria in larval settlement and metamorphosis of the polychaete Hydroides elegans).
Обыкновенно переходы между последовательными стадиями онтогенеза происходят под контролем внутренних регуляторных факторов, в частности гормонов и нейротрансмиттеров. Однако в рассматриваемом случае прохождение метаморфоза спрашивает обязательного получения внешнего сигнала, производимого бактериями. Необходимо отметить, что зависимость протекания ранних стадий онтогенеза от стимулов, изготавливаемых теми или иными бактериями или другими одноклеточными, была введена для целого ряда животных — как первичноротых, так и вторичноротых, включая стрекающих (медуз, кораллов), морских губок, крабов, двустворчатых моллюсков, асцидий и морских ежей. При этом успешность индукции метаморфоза звериного зависит не только от видового состава, но и от физиологического состояния контактирующих микроорганизмов. Все популярные случаи такого рода касаются животных, у которых есть чередование подвижных личиночных и малоподвижных взрослых стадий житейского цикла. Молекулярные механизмы осуществляемой регуляции в большинстве случаев пока остаются неизученными.
Коллектив авторов обсуждаемой труды в последние несколько лет проводил исследования, нацеленные на расшифровку молекулярных механизмов, обеспечивающих контроль метаморфоза червя H. elegans бактериями P. luteoviolacea. Итоги исследований были представлены ими в двух статьях, первая из каких вышла в журнале Science в 2014 году, а вторая — в сентябре 2016 года в журнале PNAS.
Рис. 2. Житейский цикл червя Hydroides elegans. Стрелка показывает этап, где критическую роль играет взаимодействие с бактериями. На этой стадии личинка теряет подвижность и переходит к обращению в ювенильную, а затем — во взрослую особь. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS
Целый жизненный цикл H. elegans показан на рис. 2, а на рис. 3 показаны последовательные стадии обращения свободноплавающей личинки в ювенильную особь. Этот процесс, занимающий несколько часов, в ускоренном облике можно посмотреть на видео из дополнительных материалов к обсуждаемой статье в PNAS.
Рис. 3. Стадии метаморфоза личинки червя Hydroides elegans. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS
Вначале нужно было выяснить, какие бактериальные гены необходимы для индукции метаморфоза червя. Для этого использовались штаммы бактерий с различными делециями. После экспериментального выявления делеций, нарушающих нормальное протекание метаморфоза, оставалось выяснить, какие гены располагаются в районы данных делеций. Такой подход позволил обнаружить два кластера генов, необходимых для индукции метаморфоза червя.
Первая группа генов, наименованных авторами исследования MAC (metamorphosis-associated contractile structures), включает 4 отворённых рамки считывания, кодирующих белки, гомологичные белкам хвостов сократимых фагов. В частности, ген macS кодирует белок сократимого чехла, гены macT1 и macT2 — белки внутреннего пустотелого стержня, ген macB — белок базальной пластинки. Оказалось, что эти белки экспрессируются у нескольких процентов бактериальных клеток, формируя на их поверхности крупные комплексы с упорядоченной структурой, заключающиеся из сотен стержней, организованных наподобие фаговых хвостов. Электронная микрофотография и виртуальная модель этого комплекса показаны на рис. 4. Отсутствие (делеция) какого-либо гена из комплекта MAC приводит к отсутствию этих комплексов и к неспособности бактерий инициировать метаморфоз у H. elegans (рис. 4, В, Г).
Рис. 4. А и Б — электронная микрофотография и модель комплексов фагоподобных структур, формируемых на поверхности бактерий P. luteoviolacea группой генов MAC. В и Г — итоги по определению влияния делеций различных генов или групп генов на способность бактерий инициировать метаморфоз у личинок червя. Правый столбик на графике Г демонстрирует, что вторичное внесение в бактерии генов локуса JF50_12590–JF50_12615 после его делетирования целиком восстанавливает способность бактерий инициировать метаморфоз у червя. Изображения из обсуждаемых статей в Science (Б и В) и PNAS (А и Г)
Вторая район размером около 8 тысяч пар нуклеотидов, обозначенная авторами JF50_12590–JF50_12615, вводит 6 белок-кодирующих генов. Их функции неизвестны, и гомологи у каких-либо иных организмов не обнаружены. Эта группа генов находится на расстоянии возле 12 тыс. пар оснований от группы MAC-генов. Бактерии, у которых этот участок делетирован, при присутствии полного набора MAC-генов индуцировали прохождение первых двух этапов метаморфоза (вводя утрату ресничек), но дальнейшие стадии метаморфоза отсутствовали (рис. 4, Г). Совместно с тем, отсутствие этой группы генов не препятствует формированию бактериями комплексов фагоподобных структур. Следственно, они причастны к индукции метаморфоза каким-то иным образом. Вероятно, продукты этих генов работают как усилители в обеспечении взаимодействия между клетками червя и комплексами из MAC-белков или являются шаперонами для этих белков. Проверкой этих гипотез авторы обещают заняться в дальнейших изысканиях. Таким образом, полноценный метаморфоз требует присутствия целого набора всех генов обоих вышеобозначенных локусов. На еще одном видео из добавочных материалов к обсуждаемой статье в PNAS можно увидеть прохождение метаморфоза личинок при добавлении бактерий дикого образа и отсутствие метаморфоза при добавлении бактерий, имеющих делеции кой-каких необходимых генов.
И наконец, авторы изучили те изменения на степени активности генов у червя, которые инициируются взаимодействием с бактериями и необходимы для протекания всех стадий метаморфоза. Транскрипцию генов в теле личинки определяли сквозь 5 и через 30 минут после взаимодействия личинки с белками MAC и сравнивали полученные эти с образцами личинок, не взаимодействовавших с белками MAC. Через 30 минут после инициации метаморфоза (реснички у личинок к этому моменту уже бывальщины утрачены) в теле личинок оказалась повышена экспрессия нескольких десятков генов, среди каких гены белков, отвечающих за передачу сигналов; белков межклеточной адгезии; металлопротеиназ — белков, какие у всех животных обеспечивают перестройку тканей во время морфогенеза; белков, участвующих в обеспечении врожденного невосприимчивости, а также нескольких транскрипционных факторов, среди которых и классические мишени сигнальных каскадов MAPK (эти каскады образуются серией белков, активирующих товарищ друга путем присоединения фосфатных групп).
Авторы дальше проверили, не связан ли оказываемый бактериями эффект как раз индукцией сигнальных каскадов MAPK. Для проверки этой гипотезы бывальщины проведены эксперименты с использованием специфичных ингибиторов некоторых киназ этих каскадов, а собственно киназы ERK1/2 (ингибитор U0126), p38 (ингибитор SB203580) и Jnk (ингибитор SP600125). Итоги экспериментов, показанные на рис. 5, позволили установить, что метаморфоз, инициируемый взаимодействием червя с бактериальными факторами, опосредован активацией киназ p38 и Jnk. Эти киназы активируют транскрипционные факторы, какие далее обеспечивают активацию транскрипции генов, необходимых для прохождения всех стадий метаморфоза у червя.
Рис. 5. А — компоненты классических каскадов MAPK. Показаны используемые специфичные ингибиторы кое-каких компонентов. Б — изучение дозозависимого влияния ингибитора киназы Erk1/2 на реализация метаморфоза (в данном случае никакого влияния не выявляется). В — изучение дозозависимого воздействия ингибитора киназы p38 на осуществление метаморфоза (в данном случае эффект ослепительно выражен: метаморфоз нарушается с увеличением дозы ингибитора). Г — изучение дозозависимого воздействия ингибитора киназы Jnk на осуществление метаморфоза (опять же, наблюдается неплохо выраженный эффект). Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS
Изыскание явно ждет своего продолжения. Авторы так и не выяснили пока, каким манером обеспечивается активация метаморфоза белками MAC — имеет ли место несложное взаимодействие с какими-то мембранными рецепторами клеток червя или эти фагоподобные структуры трудятся именно как шприцы (как это делают фаги), вводя какие-то индукторные молекулы в цитоплазму клеток личинки червя. Не выяснена функция еще 6 необходимых бактериальных белков. Также увлекательна эволюционная предыстория сложившихся взаимоотношений между бактериями и трубчатым червем. В чем заключается выгода любого вида от такого союза? Насколько универсальны подобные схемы межвидового взаимодействия и их механизмы?
